ランベルト・ベールの法則

ある酵素アッセイを1 cmのセルに入れ、340 nmで測定しました。画面には2.49と表示され、分析者はNADHが400 µmol/Lであると記録しました。計算自体は正しいものです。その数字の実際の価値、本来はどうすべきだったのか、そして機器が本当は何を報告していたのかを導き出してみましょう。

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1. NADHは340 nmの光を吸収し、そのモル吸光係数は6,220 L mol⁻¹ cm⁻¹です。濃度は400 µmol/L（つまり4.0000 × 10⁻⁴ mol/L）であり、セルの幅は1 cmです。法則のすべてはこれだけであり、計算結果は「吸光度 A」の下に表示されています。

   $$A=\varepsilon c\ell =6220\ \mathrm{L\,mol^{-1}cm^{-1}}\cdot 4{.}0000\times10^{-4}\ \mathrm{mol\,L^{-1}} \cdot 1\ \mathrm{cm}=2{.}4880$$

2. 吸光度は−log₁₀Tと定義されているため、これを逆算します。セルから出てくるのは、千個のうちおよそ三個の光子だけです。分析者がこれから主張しようとすることはすべて、機器がそれを千個中の二個や四個と正確に見分けられるという前提に立っています。

   $$T=10^{-A}=10^{-2{.}4880}=3{.}2509\times10^{-3}=0{.}33\%$$

3. ここで不確かさを計算してみます。機器が測定するのはTなので、cをTの式で表して微分します。εとℓは導関数と濃度そのものの両方に現れて相殺されます。つまり、相対不確かさは測定値だけに依存し、セルの中身やセルの幅には無関係なのです。

   $$c=\frac{-\log_{10}T}{\varepsilon\ell} \ \Longrightarrow\ \frac{dc}{dT}=\frac{-1}{\varepsilon\ell\,T\ln 10} \ \Longrightarrow\ \frac{\sigma_c}{c} =\frac{\sigma_T}{\varepsilon\ell\,T\ln 10}\cdot\frac{\varepsilon\ell\ln 10}{\ln(1/T)} =\frac{\sigma_T}{T\ln(1/T)}$$

4. まともな卓上機器であれば透過率スケールの0.5%程度の精度があるため、σ_T = 0.005となります。式をTではなくAで書き直せば、最初のステップですでに出た数字を使えます。ツールは「濃度の不確かさ」の下に26.85%と出力しています。答えは400 µmol/Lのプラスマイナス107です。

   $$\frac{\sigma_c}{c}=\frac{\sigma_T\,10^{A}}{A\ln 10} =\frac{0{.}005\cdot 307{.}61}{5{.}72883}=0{.}26845 \qquad 400\cdot 0{.}26845=107\ \mathrm{\mu mol\,L^{-1}}$$

5. それが最も小さくなるのはどこでしょうか。分母のT ln(1/T)を最大にしたいわけですが、これには単一の最大値があります。微分すると−ln T − 1となり、T = 1/eでゼロになります。つまり利用可能な最良の測定値はA = log₁₀e = 0.4343であり、そこでの不確かさはe·σ_T = 1.36%です。分析者の測定値は、その19.75倍のペナルティを払ったことになります。

   $$\frac{d}{dT}\bigl(-T\ln T\bigr)=-\ln T-1=0 \ \Longrightarrow\ T=\tfrac{1}{e}=0{.}36788,\quad A=\log_{10}e=0{.}4343, \quad e\,\sigma_T=0{.}013591 \qquad \frac{0{.}26845}{0{.}013591}=19{.}75$$

6. 薄すぎる測定のペナルティはA = 0.1で2.01倍です。暗すぎる測定のペナルティはA = 3で53.26倍になります。これら二つの測定値は最適値から同じくらい離れていますが、精度の差は比較になりません。だからこそ誤差パネルは対数軸で描かれており、研究室でのアドバイスが「濃縮しろ」ではなく「希釈しろ」になるのです。

   $$\begin{array}{r|rrr} A & T & \sigma_c/c & \times\ \text{floor} \\\\ \hline 0{.}1000 & 79{.}43\% & 2{.}73\% & 2{.}01 \\\\ 0{.}2000 & 63{.}10\% & 1{.}72\% & 1{.}27 \\\\ 0{.}4343 & 36{.}79\% & 1{.}36\% & 1{.}00 \\\\ 0{.}7000 & 19{.}95\% & 1{.}55\% & 1{.}14 \\\\ 1{.}0000 & 10{.}00\% & 2{.}17\% & 1{.}60 \\\\ 1{.}5000 & 3{.}16\% & 4{.}58\% & 3{.}37 \\\\ 2{.}0000 & 1{.}00\% & 10{.}86\% & 7{.}99 \\\\ 2{.}4880 & 0{.}33\% & 26{.}85\% & 19{.}75 \\\\ 3{.}0000 & 0{.}10\% & 72{.}38\% & 53{.}26 \end{array}$$

7. だから希釈しましょう。2.4880 ÷ 0.4343 = 5.73であり、これでサンプルは69.82 µmol/Lになります。これは「最適値での濃度」の下にある数字です。ピペットで一回操作するだけで、同じ機器が19.75倍も正確に答えてくれます。希釈にはそれ自体の不確かさが伴い、二乗和の平方根で加算されますが、この交換が割に合わなくなるには、その不確かさが26.8%よりも悪くなければなりません。

   $$\frac{A}{\log_{10}e}=\frac{2{.}4880}{0{.}4343}=5{.}73, \qquad c_{\text{opt}}=\frac{\log_{10}e}{\varepsilon\ell}=\frac{0{.}4343}{6220} =6{.}982\times10^{-5}\ \mathrm{mol\,L^{-1}}=69{.}82\ \mathrm{\mu mol\,L^{-1}} \qquad \sqrt{0{.}26845^{2}-0{.}013591^{2}}=0{.}268$$

8. 画面に表示されていたのは、これらのどれでもありません。0.1%の迷光があると、機器は2.3720と報告しました。これは化学反応が生み出した吸光度から4.7%も不足していますし、セルに何が入っていようと3.0004より高い数値を報告することはできなかったのです。分析者の2.49という数字は、不確かさを計算する前の段階で、すでに二重の誤差を抱え込んでいました。

   $$A_{\text{meas}}=-\log_{10}\frac{10^{-A}+s}{1+s} =-\log_{10}\frac{3{.}2509\times10^{-3}+0{.}001}{1{.}001}=2{.}3720, \qquad 1-\frac{2{.}3720}{2{.}4880}=4{.}7\%, \qquad A_{\max}=\log_{10}\frac{1{.}001}{0{.}001}=3{.}0004$$

9. モノクロメーターが提供するのは単一の波長ではありません。有限のスリット幅が吸収ピークの斜面でもたらすように、光の半分がεの20%低い位置にあると考えてみてください。検出器は二つの強度を合計し、その後に一回だけ対数を取るため、見かけの吸光度は二つの強度加重平均を下回ってしまいます。公称のAが1のとき、平均値0.9000に対して機器は0.8886と読み取ります。公称が2のときは、1.8000に対して1.7555です。不足分は濃度とともに大きくなるため、検量線はシフトするのではなく濃度軸に向かって曲がります。最適値で一点校正を行い、それをA = 3で使うと、濃度は3.03%低く出てしまいます。上のパネルにはそのようなことは一切書かれていません。二つ目のεと光束の分割は、このページが持っているよりも三つ多い操作要素なのです。

   $$A_{\text{app}}=-\log_{10}\Bigl[\tfrac12 10^{-A}+\tfrac12 10^{-0{.}8A}\Bigr]: \quad A=1\to 0{.}8886\ (\text{mean } 0{.}9000), \quad A=2\to 1{.}7555\ (\text{mean } 1{.}8000)$$